來自 丁香通 2022/3/14 閱讀原文
抗體是獲得性免疫的重要組成部分，在防御性及致病性的免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用，又因其具有高度靶向特異性、親和力和安全性,已經(jīng)在許多重大疾病的治療、診斷和預(yù)防中得到廣泛應(yīng)用, 是當(dāng)今新藥研發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)。而獲得醫(yī)用單克隆抗體或抗體片段的基因序列是進(jìn)行抗體工程及抗體人源化改造的前提，是實(shí)現(xiàn)其功能優(yōu)化至關(guān)重要的第一步。DNA測(cè)序技術(shù)的長(zhǎng)足發(fā)展為獲取抗體基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，特別是隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，使得分析抗體基因序列,特別是針對(duì)大容量、多樣性高的抗體基因庫序列的系統(tǒng)分析成為可能。
高通量測(cè)序概要
高通量技術(shù)堪稱測(cè)序技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑，該技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全貌分析成為可能，因此也稱為深度測(cè)序（deep sequencing）或者下一代測(cè)序（next generation sequencing）。 高通量測(cè)序最具代表性測(cè)序平臺(tái)有三種（圖2）：1，2005年454 Life Sciences公司推出的454 FLX焦磷酸測(cè)序平臺(tái)（454 FLX pyrosequencing platform），2006年Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺(tái)（Genome Analyzer platform），以及2007年ABI公司推出的SOLiD測(cè)序儀（ABI SOLiD sequencer），他們的共同點(diǎn)是都具有高測(cè)序通量，根據(jù)平臺(tái)不同讀取長(zhǎng)度從25bp到450bp不等，這樣一次可以讀取到1G到14G不等的堿基信息，這是傳統(tǒng)的96道毛細(xì)管測(cè)序無法達(dá)到的。由此可見第二代測(cè)序技術(shù)無需進(jìn)行電泳，操作簡(jiǎn)便。這不但大大節(jié)省了成本和時(shí)間，而且可以對(duì)數(shù)以百萬計(jì)的樣品進(jìn)行分析，這樣龐大的測(cè)序能力是傳統(tǒng)測(cè)序儀所不能比擬的。
圖2 三種具有代表性的 高通量測(cè)序技術(shù)
DNA測(cè)序技術(shù)在抗體研發(fā)的發(fā)展歷程
隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，抗體組學(xué)的研究經(jīng)歷了從低通量到高通量的技術(shù)變革。在1990~2000年間，主要利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)和Sanger測(cè)序技術(shù)研究少量B細(xì)胞的抗體特征。由于技術(shù)的低通量性，每次實(shí)驗(yàn)只能分析幾十到幾百個(gè)B細(xì)胞的抗體特性，與抗體譜的巨大數(shù)據(jù)相比，低通量技術(shù)只為我們揭示了抗體序列信息的冰山一角。
2009年Weinstein等首次應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)全面研究了斑馬魚的抗體庫特征，揭示不同斑馬魚個(gè)體間重鏈VDJ基因的使用頻率存在相似性，促進(jìn)了高通量測(cè)序技術(shù)在人抗體組分析中的應(yīng)用。下一代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用使得一次測(cè)序可獲得數(shù)以百萬計(jì)的B細(xì)胞的抗體可變區(qū)域序列，數(shù)據(jù)量更加接近人體抗體譜真實(shí)數(shù)量，抗體的研究從而進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代。
高通量DNA測(cè)序技術(shù)在抗體領(lǐng)域中的應(yīng)用
大容量和多樣性好的抗體基因庫是成功篩選功能抗體的基礎(chǔ)。目前用于基因庫篩選的所有展示技術(shù)均采用了一種表型選擇壓力的原理,即依賴于受體-配體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合力,這樣的篩選過程一方面通過展示技術(shù)富集了目標(biāo)抗體基因,另一方面可能導(dǎo)致篩選環(huán)節(jié)中的一些稀有分子、低結(jié)合力分子、可溶性表達(dá)量過低的分子或產(chǎn)量較低的抗體基因被漏篩。例如在篩選抗病毒的中和性抗體過程中,經(jīng)常發(fā)現(xiàn)獲得的高親和力抗體沒有較好的中和作用,這是因?yàn)楂@得的高親和力抗體并不是針對(duì)中和作用的靶標(biāo),因而獲得的抗體是不相關(guān)的抗體。
而DNA測(cè)序過程沒有選擇壓力,可以釋放較完整的基因庫的序列信息,有利于捕獲目標(biāo)基因。傳統(tǒng)的Sanger法在DNA測(cè)序的通量上一般最大為100kb,96孔,遠(yuǎn)不能滿足庫容在109分子以上的抗體基因庫分析的需求,而新一代高通量DNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)抗體基因庫測(cè)序提供了可能。
近年來高通量DNA測(cè)序技術(shù)在抗體領(lǐng)域中的應(yīng)用不斷增加,目前主要集中在對(duì)重組抗體庫多樣性的分析及基于抗體可變區(qū)CDR3序列測(cè)序結(jié)果的應(yīng)用。
展望
隨著高通量DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)及重組抗體技術(shù)的不斷完善，快速檢測(cè)大容量重組抗體基因庫及快速發(fā)現(xiàn)藥用抗體基因的時(shí)代到來，對(duì)整個(gè)抗體藥物研發(fā)產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用。但到目前為止，抗體組學(xué)分析技術(shù)仍受到一些現(xiàn)實(shí)條件的約束，如高通量PCR抗體基因擴(kuò)增技術(shù)仍不夠完善、測(cè)序讀段長(zhǎng)度與準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高、標(biāo)準(zhǔn)的分析流程有待開發(fā)完善。隨著單細(xì)胞分選及測(cè)序的應(yīng)用、PCR擴(kuò)增基因方法的改善、細(xì)胞標(biāo)記的應(yīng)用、分析標(biāo)準(zhǔn)的開發(fā)，未來抗體組學(xué)將在診斷、藥理學(xué)、疫苗設(shè)計(jì)及臨床應(yīng)用中發(fā)揮重大作用，引領(lǐng)新型治療性抗體研究的時(shí)代。
蘇州百達(dá)提供的服務(wù)
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