多快？3-5個(gè)工作日完成！
多貴？低于700元/樣本的價(jià)格！
多準(zhǔn)？高于Sanger 的序列結(jié)果！
為什么選擇5’RACE方法進(jìn)行擴(kuò)展？
大家都知道， 分析可變區(qū)時(shí)，設(shè)計(jì)一個(gè)通用引物來(lái)擴(kuò)增所有的抗體序列是異常困難的。重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低。這也就決定了在5’端設(shè)計(jì)多條引物的多重PCR法，先天性地會(huì)遺漏部分抗體可變區(qū)序列，造成結(jié)果不夠全面。一個(gè)有效的分析這些可變區(qū)域的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。后續(xù)可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進(jìn)行測(cè)序。 使用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中將SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端， 使得該位點(diǎn)能夠用于下游擴(kuò)增和克隆 。 使用SMARTer RACE kits具有足夠的靈敏度，可以獲得全部5’端的信息。
以合成的cDNA作為模板， 根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)的lgG的序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)H鏈, L (κ)鏈, 或L (λ)鏈的反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5′ RACE primer）進(jìn)行擴(kuò)增，得到帶有VDJ可變區(qū)全部序列的DNA片段。 取一部分PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)片段長(zhǎng)度大小，應(yīng)集中于550bp長(zhǎng)度附近。擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行下一步的測(cè)序工作得到其對(duì)應(yīng)的抗體序列。
為什么選擇Miseq測(cè)序平臺(tái)？
Miseq測(cè)序平臺(tái)是illumina公司于2011年推出的小型測(cè)序平臺(tái)，并于2018年獲得中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(CNDA)的批準(zhǔn)文書(shū)用于臨床體外診斷檢測(cè)。從推出至今，已服務(wù)超過(guò)十年的DNA測(cè)序需求，其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度高，測(cè)序通量大和單堿基測(cè)序成本低等特點(diǎn)，持續(xù)地被各大醫(yī)院，臨檢公司等使用。
Miseq測(cè)序平臺(tái)是目前唯一能夠提供高質(zhì)量的600bp讀長(zhǎng)的二代測(cè)序設(shè)備。這個(gè)讀長(zhǎng)也正好滿(mǎn)足了上述5’RACE建庫(kù)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。由于Miseq測(cè)序平臺(tái)一次能夠完成對(duì)上千萬(wàn)條片段進(jìn)行測(cè)序，其通量可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單克隆樣本的測(cè)序或者免疫組庫(kù)測(cè)序，且其單位測(cè)序成本遠(yuǎn)低于Sanger方法的成本。
蘇州百達(dá)提供的服務(wù)
基于5’RACE全面準(zhǔn)確的建庫(kù)方法和Miseq測(cè)序平臺(tái)的高質(zhì)量，高通量的測(cè)序能力，我們能夠提供快速準(zhǔn)確地抗體基因發(fā)現(xiàn)服務(wù)：
]]>10x Genomics最新的Chromium
系統(tǒng)利用油包水的微反應(yīng)體系，通過(guò)序列標(biāo)簽區(qū)別群體中的不同細(xì)胞，獲得單細(xì)胞水平的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)數(shù)千甚至數(shù)萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞群體分析。該平臺(tái)通過(guò)油滴-barcode-單細(xì)胞的對(duì)應(yīng)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)真正意義上的單細(xì)胞測(cè)序，單個(gè)樣本細(xì)胞檢測(cè)數(shù)最高可達(dá)1000-10000個(gè)，其所建的文庫(kù)與Illumina各種型號(hào)的平臺(tái)高度兼容。
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)給抗體篩選帶來(lái)了重大變革。利用該技術(shù)可以從病人外周血淋巴細(xì)胞中獲得抗原特異性的單個(gè)記憶性B細(xì)胞，并針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的抗體的重鏈 和輕鏈進(jìn)行RT-PCR，從而獲得人源的單克隆抗體。單個(gè)B細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以快速、高效地分離鑒定出抗原特異性的中和抗體，具有廣闊的應(yīng)用前景。
下圖展示了基于10X Chromium單細(xì)胞平臺(tái)進(jìn)行抗體VDJ基因序列建庫(kù)的流程圖。
目前，利用單個(gè)B細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)篩選和鑒定出多種病毒的中和抗體。Scheid等利用FACS法從感染艾滋病毒的患者中分離到對(duì)HIV抗原有親和力的記憶性B細(xì)胞，并從中篩選到大量的HIV-1特異性的中和抗體。Tsioris等通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)從人B細(xì)胞中鑒定出針對(duì)西尼羅河病毒的中和抗體。Wang等[34]從中國(guó)寨卡康復(fù)病人體內(nèi)鑒定出高效、特異的寨卡病毒單克隆抗體。該抗體能在小鼠模型上有效治療寨卡病毒感染，有望成為治療寨卡病毒感染的候選藥物。類(lèi)似地，Cox 等從人抗原特異性記憶B細(xì)胞中篩選到登革病毒的中和抗體。
]]>Illumina新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)采用克隆擴(kuò)增和邊合成邊測(cè)序（SBS）的測(cè)序化學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確的測(cè)序。該過(guò)程可在將DNA堿基整合到核酸鏈的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。每個(gè)堿基在加入不斷延伸的鏈時(shí)會(huì)發(fā)出獨(dú)特的熒光信號(hào)，該信號(hào)可用于確定DNA序列的順序。
NGS技術(shù)能用于任何生物體的DNA測(cè)序，幾乎可為所有生物學(xué)問(wèn)題提供有價(jià)值的信息。DNA測(cè)序是一項(xiàng)高度可擴(kuò)展的技術(shù)，可通過(guò)多種方法應(yīng)用于小的目標(biāo)區(qū)域或整個(gè)基因組，讓研究人員能夠探究與任何生物的基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀(guān)基因組相關(guān)的幾乎所有問(wèn)題。新一代測(cè)序（NGS）的主要區(qū)別在于DNA或RNA樣本的制備方法和使用的數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)。
Miseq平臺(tái)
Illumina公司推出的MiSeq是一臺(tái)在單個(gè)儀器上整合了擴(kuò)增、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的新一代測(cè)序儀。MiSeq有著革命性的流程和無(wú)可比擬的準(zhǔn)確性，這讓它成為快速且經(jīng)濟(jì)高效的DNA長(zhǎng)片段測(cè)序的理想平臺(tái)，適合廣泛的應(yīng)用，已被FDA大量采購(gòu)并即將通過(guò)FDA認(rèn)證。Miseq提供測(cè)序讀長(zhǎng)達(dá)到2x300bp的高質(zhì)量測(cè)序模式, 非常適合抗體VDJ基因序列測(cè)序高通量測(cè)序。
