多快？3-5個(gè)工作日完成！
多貴？低于700元/樣本的價(jià)格！
多準(zhǔn)？高于Sanger 的序列結(jié)果！
為什么選擇5’RACE方法進(jìn)行擴(kuò)展？
大家都知道， 分析可變區(qū)時(shí)，設(shè)計(jì)一個(gè)通用引物來(lái)擴(kuò)增所有的抗體序列是異常困難的。重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低。這也就決定了在5’端設(shè)計(jì)多條引物的多重PCR法，先天性地會(huì)遺漏部分抗體可變區(qū)序列，造成結(jié)果不夠全面。一個(gè)有效的分析這些可變區(qū)域的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。后續(xù)可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進(jìn)行測(cè)序。 使用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中將SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端， 使得該位點(diǎn)能夠用于下游擴(kuò)增和克隆 。 使用SMARTer RACE kits具有足夠的靈敏度，可以獲得全部5’端的信息。
以合成的cDNA作為模板， 根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)的lgG的序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)H鏈, L (κ)鏈, 或L (λ)鏈的反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5′ RACE primer）進(jìn)行擴(kuò)增，得到帶有VDJ可變區(qū)全部序列的DNA片段。 取一部分PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)片段長(zhǎng)度大小，應(yīng)集中于550bp長(zhǎng)度附近。擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行下一步的測(cè)序工作得到其對(duì)應(yīng)的抗體序列。
為什么選擇Miseq測(cè)序平臺(tái)？
Miseq測(cè)序平臺(tái)是illumina公司于2011年推出的小型測(cè)序平臺(tái)，并于2018年獲得中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(CNDA)的批準(zhǔn)文書(shū)用于臨床體外診斷檢測(cè)。從推出至今，已服務(wù)超過(guò)十年的DNA測(cè)序需求，其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度高，測(cè)序通量大和單堿基測(cè)序成本低等特點(diǎn)，持續(xù)地被各大醫(yī)院，臨檢公司等使用。
Miseq測(cè)序平臺(tái)是目前唯一能夠提供高質(zhì)量的600bp讀長(zhǎng)的二代測(cè)序設(shè)備。這個(gè)讀長(zhǎng)也正好滿(mǎn)足了上述5’RACE建庫(kù)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。由于Miseq測(cè)序平臺(tái)一次能夠完成對(duì)上千萬(wàn)條片段進(jìn)行測(cè)序，其通量可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單克隆樣本的測(cè)序或者免疫組庫(kù)測(cè)序，且其單位測(cè)序成本遠(yuǎn)低于Sanger方法的成本。
蘇州百達(dá)提供的服務(wù)
基于5’RACE全面準(zhǔn)確的建庫(kù)方法和Miseq測(cè)序平臺(tái)的高質(zhì)量，高通量的測(cè)序能力，我們能夠提供快速準(zhǔn)確地抗體基因發(fā)現(xiàn)服務(wù)：
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