多快？3-5個工作日完成！
多貴？低于700元/樣本的價格！
多準？高于Sanger 的序列結果！
為什么選擇5’RACE方法進行擴展？
大家都知道， 分析可變區(qū)時，設計一個通用引物來擴增所有的抗體序列是異常困難的。重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低。這也就決定了在5’端設計多條引物的多重PCR法，先天性地會遺漏部分抗體可變區(qū)序列，造成結果不夠全面。一個有效的分析這些可變區(qū)域的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設計簡并引物。后續(xù)可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進行測序。 使用SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒，在反轉錄過程中將SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端， 使得該位點能夠用于下游擴增和克隆 。 使用SMARTer RACE kits具有足夠的靈敏度，可以獲得全部5’端的信息。
以合成的cDNA作為模板， 根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫注冊的lgG的序列，設計了針對H鏈, L (κ)鏈, 或L (λ)鏈的反轉錄引物（RT primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5′ RACE primer）進行擴增，得到帶有VDJ可變區(qū)全部序列的DNA片段。 取一部分PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳確認片段長度大小，應集中于550bp長度附近。擴增產物再進行下一步的測序工作得到其對應的抗體序列。
為什么選擇Miseq測序平臺？
Miseq測序平臺是illumina公司于2011年推出的小型測序平臺，并于2018年獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局(CNDA)的批準文書用于臨床體外診斷檢測。從推出至今，已服務超過十年的DNA測序需求，其數(shù)據(jù)的準確度高，測序通量大和單堿基測序成本低等特點，持續(xù)地被各大醫(yī)院，臨檢公司等使用。
Miseq測序平臺是目前唯一能夠提供高質量的600bp讀長的二代測序設備。這個讀長也正好滿足了上述5’RACE建庫得到的擴增產物測序。由于Miseq測序平臺一次能夠完成對上千萬條片段進行測序，其通量可以實現(xiàn)大規(guī)模單克隆樣本的測序或者免疫組庫測序，且其單位測序成本遠低于Sanger方法的成本。
蘇州百達提供的服務
基于5’RACE全面準確的建庫方法和Miseq測序平臺的高質量，高通量的測序能力，我們能夠提供快速準確地抗體基因發(fā)現(xiàn)服務：
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